貓α干擾素（IFN-α）elisa試劑盒說明書

elisa試劑盒常見組成部(bu)分(fen)：

1）酶(mei)和底物：在ELISA中zui常用的(de)酶(mei)為HRP和ALP。

2）抗(kang)(kang)體(ti)(ti)：在(zai)ELISA中應用的抗(kang)(kang)體(ti)(ti)可分為多(duo)(duo)克(ke)隆抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(多(duo)(duo)抗(kang)(kang))和單克(ke)隆抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(單抗(kang)(kang))。

3）抗(kang)原(yuan)：在ELISA中應用(yong)的抗(kang)原(yuan)要求(qiu)有較高(gao)的特異性、親(qin)和力和純(chun)度。主要有三類，即自然抗(kang)原(yuan)、人(ren)工合成抗(kang)原(yuan)和基因重組抗(kang)原(yuan)。

4 包被(bei)：將免疫活性(xing)物質(抗(kang)原或抗(kang)體)結合于固(gu)相載體上的過程稱為包被(bei)。常(chang)用(yong)的材料有聚(ju)苯乙烯、硝酸纖維薄膜等(deng)；常(chang)用(yong)的方法(fa)(fa)有吸附法(fa)(fa)、化學(xue)交聯(lian)法(fa)(fa)及親和素(su)-生物素(su)間(jian)接包被(bei)法(fa)(fa)

5）固(gu)相載(zai)(zai)體：固(gu)相載(zai)(zai)體是ELISA中(zhong)用以分離結(jie)合標(biao)記物(wu)和(he)游離標(biao)記物(wu)的主要(yao)手段，應與各種(zhong)免(mian)疫(yi)活(huo)性(xing)(xing)物(wu)質有(you)良好的結(jie)合性(xing)(xing)能并且(qie)不(bu)改變其免(mian)疫(yi)活(huo)性(xing)(xing)。常用的固(gu)相載(zai)(zai)體有(you)聚苯乙烯塑料和(he)硝(xiao)酸纖維素(su)膜。

樣本實驗前準備：

ELISA試(shi)劑盒(he)液體樣(yang)本：包括(kuo)血清、血漿、尿液、胸腹水、腦(nao)脊液、細(xi)胞(bao)培養上清等。

（1）血清

室溫血液自然(ran)凝固10-20分鐘后，離(li)心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集(ji)上清。保存過(guo)程中(zhong)如有沉淀形(xing)成，應再次離(li)心。

（2）血漿：

應根據(ju)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑(ji)，混合10-20分(fen)鐘(zhong)后，離心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)）。仔細收(shou)集上清。保存(cun)過程中(zhong)如有沉淀(dian)形成(cheng)，應再(zai)次離心。

（3）尿液：

用無(wu)菌管收(shou)集。離心20分鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分）。仔細收(shou)集上清。保存過程(cheng)中(zhong)如(ru)有沉(chen)淀形成，應再(zai)次(ci)離心。胸腹水、腦脊液參(can)照此(ci)實行。

（4）細胞(bao)培(pei)養上清：

檢測分泌性的(de)成份時，用(yong)無(wu)菌管收集。離心(xin)20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細(xi)收集上(shang)清(qing)。

（5）培養細胞

檢測細(xi)胞內的成(cheng)份(fen)時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xi)胞懸液，細(xi)胞濃度達到100萬/ml左(zuo)右。通過反復凍(dong)融或加(jia)入組(zu)織(zhi)蛋白(bai)萃取試劑，以使細(xi)胞破(po)壞并(bing)放出細(xi)胞內成(cheng)份(fen)。離心20分(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zi)細(xi)收集上清。保存(cun)過程中如(ru)有沉淀(dian)形成(cheng)，應再次(ci)離心。

（6）組織標本

切割(ge)標本(ben)后，稱取重(zhong)量。加入一(yi)定量的(de)(de)PBS，PH7.4。用液(ye)氮迅速冷凍(dong)保(bao)存(cun)備用。標本(ben)融(rong)化后仍然(ran)保(bao)持(chi)2-8℃的(de)(de)溫度(du)。加入一(yi)定量的(de)(de)PBS（PH7.4），或(huo)組織(zhi)蛋白(bai)萃取試劑, 用手工或(huo)勻漿(jiang)器將標本(ben)勻漿(jiang)化。離心(xin)20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細(xi)收集(ji)上(shang)清。分裝(zhuang)后一(yi)份(fen)待(dai)檢測，其余(yu)冷凍(dong)備用。

操作步驟

1. 標準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)的稀(xi)釋(shi)(shi)與加(jia)(jia)樣(yang)：在(zai)酶標包被板上設標準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)10孔(kong)(kong)(kong)，在(zai)di一(yi)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)100μl，然(ran)(ran)后(hou)(hou)在(zai)di一(yi)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻；然(ran)(ran)后(hou)(hou)從di一(yi)孔(kong)(kong)(kong)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)二(er)孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)取(qu)100μl分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)三孔(kong)(kong)(kong)和(he)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)，再(zai)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)三、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻；然(ran)(ran)后(hou)(hou)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)三孔(kong)(kong)(kong)和(he)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)四孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)先(xian)各(ge)取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)，再(zai)各(ge)取(qu)50μl分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)取(qu)50μl分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)七、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)七、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻后(hou)(hou)從第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)七、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)八(ba)孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)五、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)五、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)液(ye)50ul，混(hun)(hun)勻；混(hun)(hun)勻后(hou)(hou)從第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)五、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)六孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)取(qu)50μl加(jia)(jia)到(dao)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)、第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)，再(zai)在(zai)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)加(jia)(jia)標準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)釋(shi)(shi)液(ye)50μl，混(hun)(hun)勻后(hou)(hou)從第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)九(jiu)第(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)(di)十孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)各(ge)取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)。（稀(xi)釋(shi)(shi)后(hou)(hou)各(ge)孔(kong)(kong)(kong)加(jia)(jia)樣(yang)量都為50μl，濃度(du)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)(bie)(bie)為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)：分別設空白孔(kong)(kong)（空白對(dui)照(zhao)孔(kong)(kong)不加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品及(ji)酶(mei)標試劑(ji)，其余各(ge)步操作相同）、待測樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品孔(kong)(kong)。在(zai)酶(mei)標包(bao)被板(ban)上待測樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品孔(kong)(kong)中先加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品稀釋液40μl，然(ran)后(hou)再加(jia)待測樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品10μl（樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品最(zui)終稀釋度為5倍）。加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)將樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品加(jia)于酶(mei)標板(ban)孔(kong)(kong)底部，盡量不觸及(ji)孔(kong)(kong)壁(bi)，輕(qing)輕(qing)晃動混勻。

3. 溫育(yu)：用封板膜封板后置37℃溫育(yu)30分鐘。

4. 配液：將30（48T的(de)20倍）倍濃縮洗滌液用(yong)蒸餾水30（48T的(de)20倍）倍稀釋(shi)后備(bei)用(yong)。

5. 洗滌：小心揭(jie)掉封板(ban)膜，棄去液體，甩干(gan)，每孔加滿洗滌液，靜置30秒(miao)后棄去，如此重復5次，拍干(gan)。

6. 加酶(mei)：每孔(kong)加入酶(mei)標試劑50μl，空白孔(kong)除外。

7. 溫育(yu)：操作同3。

8. 洗滌：操(cao)作(zuo)同5。

9. 顯(xian)色：每孔(kong)先加入(ru)顯(xian)色劑A50μl，再加入(ru)顯(xian)色劑B50μl，輕(qing)輕(qing)震(zhen)蕩混勻，37℃避光(guang)顯(xian)色15分鐘.

10. 終止：每(mei)孔加終止液50μl，終止反應(ying)（此時藍色(se)(se)立轉黃色(se)(se)）。

11. 測定(ding)(ding)：以(yi)空(kong)白空(kong)調零，450nm波長依序(xu)測量(liang)各孔的(de)吸光度（OD值）。 測定(ding)(ding)應(ying)在加終(zhong)止液后15分鐘(zhong)。

注意事項

1. 試劑盒從冷(leng)藏環境中取出應(ying)(ying)在室溫平衡15-30 分鐘后方(fang)可使用，酶(mei)標包被板(ban)開(kai)封(feng)后如未用完(wan)，板(ban)條應(ying)(ying)裝入密封(feng)袋中保存。

2. 濃洗(xi)滌液可能會有結晶(jing)析出，稀釋時可在水(shui)浴中(zhong)加(jia)溫助溶，洗(xi)滌時不影(ying)響結果。

3. 各步加(jia)樣均應使用加(jia)樣器，并經常校對其準確(que)性，以(yi)避免試驗誤(wu)差。一次(ci)加(jia)樣時(shi)間好(hao)控制在5 分鐘內(nei)，如(ru)標本(ben)數量(liang)多，推薦使用排槍加(jia)樣。

4. 封板膜只限一次性使(shi)用(yong)，以避免交叉污染。

5. 底物請避光保(bao)存。

6. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標(biao)儀讀(du)數為準.

7. 所有樣(yang)品，洗滌液和各種廢棄物(wu)都(dou)應按傳染物(wu)處理。

8. 本試劑不(bu)同批(pi)號組分不(bu)得(de)混用。

9.如需代測或者樣本(ben)暫時不測定(ding)，可(ke)立即低溫(wen)凍存，溫(wen)度(du)越(yue)低越(yue)好，中間避免反復凍融，-20℃以(yi)下可(ke)保存三個月(yue)(yue),-70℃以(yi)下可(ke)保存六個月(yue)(yue)。

10.試劑使用須知：

11.（1）請參(can)照(zhao)相關法規(gui)、文獻(xian)、MSDS等信息，理解并掌握好試劑的特(te)性，再進行安全操作。

12.（2）通常購買試劑時一定要想到一次性用完。若(ruo)估算(suan)不足(zu)有(you)剩(sheng)余的話(hua)，更加注(zhu)意其他保管和(he)管理。

13.（3）萬一試劑操作者并非專業技術人員。必(bi)須在(zai)專業人士的指導監(jian)督下進行操作。對于使用后的廢棄物，不要或者舊的試劑，應(ying)按(an)照相關法律法規正當處理。

14.（4）購買后，請務必(bi)(bi)確(que)認標(biao)簽(qian)(qian)上(shang)的(de)注(zhu)意事項；做好預防(fang)顛(dian)倒，摔壞的(de)措(cuo)施和(he)管理(li)體(ti)制；在使用前再次確(que)認標(biao)簽(qian)(qian)上(shang)的(de)注(zhu)意事項，做好必(bi)(bi)要的(de)安全對策；對沒有(you)標(biao)明其危(wei)害(hai)特性、有(you)害(hai)特性的(de)，也要慎重地(di)進(jin)行(xing)(xing)操作；必(bi)(bi)須帶好防(fang)護用具(ju)，小(xiao)心翼翼進(jin)行(xing)(xing)操作。